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北京细胞培养支原体污染

关键词：北京细胞培养支原体污染支原体

2024.06.08

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细胞培养中支原体污染的检测方法有多种，以下是一些常用的检测手段：

1. 显微镜检测：通过相差显微镜观察细胞，支原体在细胞表面和细胞之间会呈现为暗色微小颗粒。

2. 荧光染色法：使用荧光染料Hoechst 33258与DNA特异性结合，使支原体的DNA着色，然后在荧光显微镜下观察。染色后的支原体会在细胞周围或附于细胞膜表面显示为亮绿色小点。

3. 电镜检查：使用扫描电镜或透射电镜观察，这是一种简便快速的方法。

4. 聚合酶链反应（PCR）：使用特定的引物对支原体DNA进行扩增，是一种高灵敏度的检测方法。

5. 等温扩增法：基于LAMP技术，室温反应后观察颜色变化确认是否有支原体污染。

支原体检测方法LAMP法的应用。北京细胞培养支原体污染

支原体是一类细菌，由于缺乏细胞壁，具有灵活的膜结构。这使得支原体的形态多变，很难在高倍显微镜下识别。并且能够抵抗压力、温度、渗透压和脱水，对许多针对细胞壁合成的常见抗*素具有抗性。它们的体积非常小，直径通常在0.15~0.3μm，因此能够轻易地穿过过滤系统。支原体能在哺乳动物细胞培养中可以高浓度生长，而不引起明显的混浊或其他可见的污染迹象。

支原体通过特殊的前端细胞器与宿主细胞结合。支原体前端细胞器富含粘附素，可以附着在真核细胞上并穿透宿主细胞。支原体缺乏刚性细胞壁，可能有助于其与宿主细胞膜融合，并交换其膜和细胞质成分。支原体的对细胞的毒性包括支原体侵袭性、分泌的致病酶和一些膜成分等都能够有效地侵犯宿主。

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支原体的预防可通过以下方式：

1. 控制污染源：通过定期检测和去除细胞培养中的支原体污染，确保细胞培养体系内无支原体存在，从而获得准确有效的实验数据。

2. 改善无菌操作技术：通过提高实验人员的操作技术和意识，避免在细胞培养过程中引入支原体污染。

3. 使用无菌设备和耗材：使用无菌的细胞培养设备和耗材，如无菌培养基、血清等，减少支原体污染的风险。

4. 定期消毒和清洁：对实验室环境进行定期的消毒和清洁，包括工作台、培养箱等，以减少支原体的潜在污染。

5. 使用预防性试剂：使用专门针对支原体的预防性试剂，如加入细胞培养基中的预防剂、超净台喷雾、水浴锅预防和细胞培养箱水盘预防等，以预防支原体污染。

6. 提高实验室人员对支原体污染的认识：通过科普教育和培训，提高实验室人员对支原体污染的认识和预防意识。

7. 建立严格的实验室管理规程：制定并执行严格的实验室管理规程，包括样本处理、废物处理、设备维护等，以降低支原体污染的风险。

在科研中，支原体检测是确保细胞培养纯净性的重要环节。以下是一些在科研中常见的支原体检测方法：

1. 支原体培养法：这是一种传统的检测方法，通过将细胞培养物接种到特定的培养基中，观察是否有支原体生长。这是直接的检测方法，但耗时较长，通常需要数周时间。

2. DNA染色法：使用荧光染料（如Hoechst或DAPI）染色细胞核，然后通过荧光显微镜观察。这种方法操作简便，可以快速得到结果，但特异性不高，可能会有假阳性。

3. 聚合酶链反应（PCR）法：这是一种分子生物学技术，通过设计特异性的引物，扩增支原体DNA，从而检测支原体的存在。PCR法具有高灵敏度和特异性，已成为日常细胞培养维护的可靠方法。

4. 核酸扩增技术（NAT）：NAT技术通过扩增并检测特定的支原体基因组保守序列来进行支原体污染检测，具有快速、简便的特点。

支原体预防的实验步骤？

检测新鲜培养基是否有支原体污染，可以采用以下五种方案：

1. 培养法：这是一种传统且可靠的方法，通过将培养基接种到适宜支原体生长的微生物培养基或琼脂平板上，观察是否有支原体生长。这种方法较为耗时，但成本较低。

2. 荧光染色法：使用特定的荧光染料（如Hoechst 33258）对细胞进行染色，然后在荧光显微镜下观察。如果存在支原体污染，可以看到细胞表面或细胞间隙中支原体DNA的荧光染色。

3. PCR法：通过设计针对支原体特定序列的引物，利用PCR技术特异性扩增目标DNA。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，如果出现条带则表明存在支原体污染。

4. 电镜观察法：使用电子显微镜直接观察培养细胞中的支原体污染情况。这种方法可以提供直观的支原体形态信息，但设备要求较高。

5. 一步法恒温支原体检测：使用特定的试剂盒，如Yeasen一步法恒温支原体检测试剂，采用等温扩增技术，通过颜色变化（由蓝紫色变为天蓝色）进行快速检测。

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细胞培养中支原体为什么难以彻底消灭？北京细胞培养支原体污染

支原体污染后的细胞是否应该直接丢弃还是尝试重新培养，这取决于多种因素，包括细胞的重要性、污染的程度、以及是否有有效的方法来清*支原体。以下是一些处理支原体污染的常见方法：

1. 直接丢弃：对于非重要的细胞，如果培养中的细胞、WCB的细胞等，可以采取直接将培养物与用过的培养基灭活后丢弃的方式。

2. 使用支原体清除剂：支原体清除剂处理细胞，作用浓度为25μg/ml，两周可以清*支原体。

3. 使用支原体清*培养基：每2~3天更换一次新鲜培养液，并用无菌的PBS洗涤细胞，处理15天后进行支原体检测，以确定支原体是否被完全去除。

4. 支原体去除试剂：这是一种混合制剂，可以通过抑制DNA和支原体生长所必须的相关蛋白合成来取得良好的支原体清*效果，且对细胞无伤害

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