广东免疫共沉淀检测CoIP-Mass检测

Co-IP（共免疫沉淀）常用于研究蛋白质之间的相互作用。当你想探究两个或多个蛋白质是否在细胞内形成复合物，或者验证某个蛋白质是否与你感兴趣的蛋白质有相互作用时，就会用到Co-IP。如果你正在研究一个未知的蛋白质功能，并且怀疑它可能与已知的某个蛋白质有相互作用，那么你可以使用Co-IP来验证这种相互作用。通过共转染或共表达这两个蛋白质，并使用针对其中一个蛋白质的抗体进行免疫沉淀，你可以检测另一个蛋白质是否被共沉淀下来，从而验证它们之间的相互作用。此外，Co-IP还可以用于研究信号转导通路中的蛋白质复合物，以及蛋白质在细胞内的定位和功能。蛋白质与蛋白质分子互作实验方法介绍。广东免疫共沉淀检测CoIP-Mass检测

免疫共沉淀CoIP实验，细胞的收集及裂解方法如下：

收集2E7个细胞样品，加入PBS洗涤细胞，离心后弃上清收集细胞沉淀。

准备500μl预冷的CellLysisBuffer,分别加入5μlProteaseInhibitor、5μlPMSF，混匀后加进细胞沉淀中吹打均匀，冰上孵育30min，期间涡旋混匀几次。

4℃,12000rpm离心10min，取上清，进行蛋白浓度测定及后续实验。广州基云生物，在IP互作组检测和关键机制分子筛选验证领域，具有丰富的经验，助力您的互作机制研究，欢迎垂询合作。 广东免疫共沉淀检测CoIP-Mass检测免疫共沉淀实验的注意事项主要包括几点。

免疫共沉淀也存在一些局限性。例如，它可能无法检测到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用。此外，两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用。此外，实验前需要预测目的蛋白以选择相应的抗体，因此，如果预测不正确，实验可能无法得到结果，这使得这种方法具有一定的冒险性。总的来说，免疫共沉淀是一种强大的技术，它能够为我们提供关于蛋白质相互作用的宝贵信息。然而，为了得到准确和可靠的结果，我们需要谨慎地解释和分析实验数据，并考虑到这种方法的局限性。

IP-WB（免疫沉淀-Western Blot）实验流程主要包括以下步骤：样品制备：收集细胞或组织样品，进行适当的裂解处理，以释放细胞内的蛋白质。免疫沉淀：将特异性抗体与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。随后，将复合物与固相载体（如磁珠）结合，通过洗涤去除非特异性结合的杂质。电泳分离：将免疫沉淀得到的蛋白质复合物进行SDS-PAGE凝胶电泳，根据分子量大小将蛋白质分离成不同的条带。转膜：将凝胶上的蛋白质转移到固相膜上，以便进行后续的Western Blot检测。Western Blot检测：利用特异性抗体检测目标蛋白或其相互作用伙伴的存在。通过显色反应可视化目标蛋白，观察并记录结果。以上步骤完成后，可以对Western Blot结果进行分析，从而验证蛋白质之间的相互作用情况。IP-WB实验操作步骤有哪些。

CoIP-Mass和CoIP-WB检测要点：

试验设计：尽量进行试验组别设计和进行生物学重复检测，提高后续验证的阳性率。常规过表达单组（AbIPvsIgGIP）；动态互作组学（实验组vs对照组vsIg组）。根据目的设计适当的生物学重复。如果后续以CoIP-Mass数据进行互作组标准分析，则需要3-4组生物学重复；如果后续以寻找关键互作蛋白，进行机制深入研究，则建议1-2次生物学重复。经验显示单次重复假阳性率90%。

蛋白表达和细胞量：细胞用量要求大(2-10e7细胞量），建议不少于5e7（金标准：320g离心细胞量50μl，保障项目用量）。低表达蛋白，建议使用过表达组进行检测。蛋白表达可根据WB结果或初步根据数据库判定（ProteomicsDB；HumanProteinAtlas）。 Co-IP外源检测需注意蛋白互作真实性、表达系统与标签选择、规范操作及结果验证，确保准确性！重庆免疫沉淀检测CoIP-Mass

免疫共沉淀法特异性强、可控性高，可用于研究蛋白互作，反映天然状态，可逆且操作简便。广东免疫共沉淀检测CoIP-Mass检测

结合了抗体的磁珠或树脂（Beads）与样本裂解液孵育，通过”抗原-抗体“之间的免疫作用，诱饵蛋白被吸附在Beads上，与此同时，诱饵蛋白的互作蛋白，也一起“共沉淀”到Beads上。洗涤去掉未结合的蛋白后，再用洗脱缓冲液将互作蛋白复合物从Beads上洗脱下来，得到免疫共沉淀（Co-IP）产物。Co-IP产物既可以用WesternBlot检测已知蛋白，也可以用质谱鉴定未知蛋白。当没有合适的诱饵蛋白抗体时，还可以通过表达融合了Flag标签的诱饵蛋白，利用Flag标签抗体做免疫沉淀。即样本过表达Flag-Bait，经裂解后与anti-Flag珠子孵育，诱饵融合蛋白与Beads结合，其互作蛋白“共沉淀”到Beads上，再经洗涤、洗脱后，用WB或质谱检测。广东免疫共沉淀检测CoIP-Mass检测