天津重组药物支原体检测使用性验证

MycoSHENTEK^® 支原体 DNA 校准品作为 NAT 检测的关键辅助试剂，采用质粒 DNA 制备，从根源上消除了污染风险，使用更安全。该校准品主要用于验证支原体 NAT 检测的灵敏度，以及校准品浓度对数与 Ct 值的线性关系，为检测方法的定量准确性提供保障。产品采用 DNA 稀释液进行系列梯度稀释，操作简便高效，无需复杂预处理；同时具备极强的专属性，不受其他种属 DNA 干扰，耐用性突出，可在不同实验条件下保持性能稳定。其标准化的特性使其成为生物制品企业开展支原体检测方法验证、日常质量控制校准的理想选择，助力检测结果的准确可靠。

支原体 NAT 检测中常见三类问题，其成因多与样品基质、操作规范或污染防控相关。1、样品基质干扰，高浓度 DMSO、人血白蛋白等冻存保护剂，高浓度细胞、DNA 碎片等复杂成分，会抑制检测反应或干扰信号读取。2、检测曲线异常，表现为非特异性扩增图谱，多因引物设计不当、反应条件优化不足或试剂交叉污染导致。3、阴性污染，具体体现为无模板对照（NTC）、阴性对照（NCS）出现翘尾现象，主要源于实验室分区不合理、操作流程不规范（如阴阳性样本交叉处理）、耗材污染或环境气溶胶污染，这些问题均会影响结果判定的准确性，需针对性解决。

对照菌株的合理配置是支原体培养法检测准确性的重要保障，湖州申科严格遵循 USP 标准制定菌株使用规范。每次检测需至少包含两株已知支原体菌株：一株为葡萄糖发酵型（如肺炎支原体或其等效种株），另一株为精氨酸水解型（如口腔支原体），通过两类菌株的平行对照，覆盖常见支原体检测场景。特殊场景下需额外补充菌株：检测昆虫细胞系时，需纳入螺原体（如 S.citri ATCC 29747、S.melliferum ATCC 29416 或等效菌种菌株），这类菌株营养需求更苛刻，且需匹配昆虫细胞系对应的较低孵化温度，确保特殊样品检测的针对性与有效性，避免因菌株配置不全导致漏检风险。

菌株质量是支原体检测 NAT 方法验证合规的关键，GC/CFU 比（基因组拷贝数与菌落形成单位比值）是关键控制指标。支原体存在聚集特性，单一 CFU 可能对应多个菌体，且 DNA 复制与细胞分裂不同步，部分菌体无法形成菌落但会释放 DNA，导致 GC/CFU 比波动大（研究报道 0.1 CFU 对应 30-500 个基因组拷贝）。若使用高 GC/CFU 比菌株，会高估检测限、导致方法灵敏度不足，因此法规明确要求菌株 GC/CFU 比＜10。2024 年 EDQM 36.1 草案规定参考品 GC/CFU 比应小于 10，USP 77 征求意见稿要求表征菌株 GC/CFU 比、建立菌株库 CFU 与核酸拷贝数关系，JP G3-14-170 也对菌株质量提出明确要求，凸显合规菌株选择的重要性。

针对不同类型的样品基质，需采用定制化的支原体检测前处理方案，以消除干扰、提升检测效果。细胞悬液需经热处理、样品处理液作用、细胞碎片去除、浓缩离心，再 55℃消化；上清或高浓度质粒样品需先浓缩离心，再用样品处理液作用后 55℃消化；5% 人血白蛋白样品则采用浓缩离心 + 样品处理液作用 + 25℃消化的流程。常见干扰基质包括冻存保护剂、高浓度细胞、代谢产物等，优化前处理可遵循三大原则：提取前通过离心取上清或去除抑制剂预处理样品；高浓度蛋白样本提取时增加蛋白酶 K 用量，增强蛋白降解效果；细胞类样品适当降低细胞数或先裂解细胞，减少细胞基质对检测的干扰。

阴性翘尾是支原体 NAT 检测中常见的异常现象，表现为 NCS 或 NTC 出现扩增信号，Ct 值多在 35~40 之间，需科学评估并处理。首先考虑污染因素，可能是阴性对照被阳性样本、试剂或环境气溶胶污染，建议立即复测，复测时使用带滤芯低吸附 TIP 头，严格执行阴阳性分区操作，注重细节防控。其次需排除背景信号等非典型性扩增的干扰，避免误判为污染。若前期验证中频繁出现 NTC 或 NCS 扩增，且已彻底排除污染可能性，可结合已有实验数据重新设置 Cut off 值，确保阈值线能有效区分真实阳性与背景信号，满足实验室检测需求。